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组织透明化方法知多少

———— 发布时间:2021-08-23   编辑:互联网  阅读次数:38 ————


近年来组织透明化方法发展得如火如荼,目前组织透明化方法有油性,基于水凝胶和水性的组织透明化方法。其中油性组织透明化方法主要有BABB, 3DISCO, uDISCO,FDISCO和 PEGASOS等,基于水凝胶的透明化方法有CLARITY和SHIELD,水性组织透明化方法有CLearT/CLearT2,SeeDB, FRUIT, Scale和CUBIC等方法。乱花渐欲迷人眼,面对种类如此繁多的透明化方法,我们又该如何选择呢?那么就让我们一起来看看每种透明化方法有什么优缺点吧!




1. 油性组织透明化方法


油性组织透明化技术主要是应用含有高折射率介质的光学透明剂取代组织中水分和脂质来平衡组织折射率,使组织达到光学透明。油性组织透明化方法具有较强的透明化效果,但是组织中的荧光蛋白容易被破坏,信号保存度低。


BABB透明化方法采用梯度浓度的乙醇对生物样本进行脱水,随后用BABB试剂匹配组织的折射率。该方法是一种快速且透明性好的生物组织透明化方法,能够充分的透明胚胎和幼鼠的脑,但是乙醇脱水会导致内源性荧光蛋白淬灭,因而限制了该方法在含转基因荧光蛋白的组织样品中使用。为了解决这一问题,采用四氢呋喃代替乙醇脱水,同时应用二苄醚(DBE)替代BABB提高透明效率,开发出了基于四氢呋喃和DBE的新型透明化方法3DISCO。3DISCO能够快速透明多种器官组织,包括小鼠大脑,肺脏,肿瘤及人类胚胎等,并有效延长了荧光蛋白的表达时间。虽然3DISCO能够保护内源性荧光蛋白,但是DBE的降解产物如过氧化物或醛类物质,会对荧光蛋白产生有害干扰,使荧光蛋白信号仅能维持几天。为了更有效的保存内源性荧光蛋白,一种基于二苯醚(DPE)的透明化技术uDISCO,可以高效透明啮齿类动物及临床人类标本,有效保存荧光蛋白信号长达数月,但是对于绿色荧光蛋白表达水平较低的样品,该方法保存荧光蛋白信号的能力并不理想。a-uDISCO是在uDISCO的基础上发展出来的,通过调整PH值从而提高了样本的信号强度和稳定性。但是uDISCO和a-uDISCO对色素含量较高及硬组织的透明效果欠佳。为了提高透明效果,一种基于聚乙二醇(PEG)的新型全组织透明技术PEGASOS被开发,该方法脱钙,脱色,脱水,脱脂等优化处理,首次实现了对动物软、硬组织的同时透明化。虽然PEGASOS具有较好的透明化效果,也适用于生物体不同类型的组织。然而此类方法也存在透明试剂毒性较大,易溶解物镜结构中的粘合剂、操作步骤繁琐,组织脱水收缩等不足之处。


油性组织透明化方法能够快速高效透明多种样本组织,但是油性试剂透明会导致样本皱缩,对组织结构和蛋白具有潜在的破坏性,且所使用试剂具有一定的毒性和腐蚀性,限制了油性透明化方法的广泛应用。



2. 水性组织透明化方法


由于油性透明化存在的诸多缺点和局限性导致水性透明化方法应运而生。水性透明化与油性透明化方法的较大的区别在于选择的生化试剂是否有强亲水性。由于组织中荧光蛋白分子上带有亲水基团,与油性溶剂相比亲水溶剂更有利于荧光蛋白信号的保存。更适用于自带荧光的组织样本的透明化。亲水性试剂透明主要包括:单纯浸泡透明和高水化脱脂透明。


浸泡型透明化技术是将样品浸泡在高折射率溶液中利用渗透压使组织逐渐透明化,该方法不去除脂质,利用高折射率溶液替换组织内外的液体,以平衡折射率,浸泡型透明化方法常适用于较小样本的透明化处理。ClearT是基于甲酰胺的浸泡型透明化方法,该方法透明速度快,成像效果好,但会使组织略微膨胀,且会使样本荧光信号淬灭。PEG可以稳定蛋白质构象,继而发展了可保留荧光蛋白的ClearT2的透明化技术,但该方法透明度比clearT低,透明化能力受限。SeeDB技术以果糖和硫代甘油为主要成分。能在几天内将样本透明化,且体积变化小,并可以与亲脂性染料兼容。但该方法因果糖黏度大导致在组织内的渗透性较低。由于SeeDB黏度极高,在SeeDB基础上衍生了FRUIT透明化方法,该方法选择尿素作为试剂中另一成分,降低了果糖黏度,大大提高试剂流动性和渗透性,加速了试剂在组织中的扩散速率。虽然浸泡型透明化操作比较简单方便,但浸泡型透明化方法不能去除脂质,因此通过该方法处理的样本透明度有限。


去除样本的脂质可以显著提高透明化的效率和质量,胺基醇类和去垢剂类物质如SDS、Triton X-100可以有效去除脂类物质。水化法通过在透明化过程中去除脂质后,利用水化作用降低样本折射率进而实现组织透明化。由于尿素具有很强的水化能力,Scale透明化技术就是基于尿素水化作用的一种透明化方法,该方法可保留荧光信号,但该方法操作时间较长,且易导致组织破碎。CUBIC在Scale技术之上添加了胺基醇,可以清除血红素使组织脱色,提高透明化水平。UbasM也是一种基于尿素,葡甲胺和糖类的透明化方法,透明速度快,荧光信号保护较好且膜脂完整的一种透明化方法,可对厘米尺度的样品进行透明和三维成像。




3. 水凝胶组织透明化方法


去垢剂可以高效的去除样本中的脂类物质,但是高浓度的去垢剂处理样本可能会使样本发生形变。通过将样本包埋在水凝胶中,使水凝胶与样本中的蛋白质和核酸分子形成共价连接便可固定和保护细胞结构,再将样本置于透明化试剂中即可避免样本发生这种形变。CLARITY透明化方法利用凝胶包埋样本,并利用电场力去除样本的脂质从而使样本快速透明。SHIELD透明化方法通过环氧化合物P3PE固定组织实现蛋白的保护,之后使用SDS进行被动或主动除脂。

油性透明化方法透明的样本透明度高,速度快,能适用于多种组织和器官。但是油性方法所使用的试剂大多毒性较强,并且容易淬灭内源性荧光蛋白的信号,不能和细胞膜上亲脂染料相兼容,样本会有明显收缩,组织或器官内部精确三维结构丢失。水性透明化方法虽然可以部分解决荧光蛋白易淬灭的问题,但是也存在透明时间长,透明能力低的缺点。水凝胶透明化方法操作过程复杂,且需要一定的设备。



面对种类如此繁多的透明化方法,我们该如何进行选择呢?


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